实验指南 实验指南

最小化 最大化

一、实验室安全事项

1、化学实验注意事项。

2、生物实验注意事项。

3、国内外实验室事故案例与原因。

 

二、生物、医学实验

1、聚合物表面细胞形态分析
2、MTT实验
3、核酸、蛋白电流
4、实时定量PCR
5、碱性磷酸酶检测
6、共聚焦显微镜免疫荧光分析
7、钙沉积染
8、生物矿化实验
9、组织细胞固定方法
10、动物模型

 

三、化学、材料实验

1、手套箱使用方法

2、转矩流变仪使用方法

3、扫描电镜测试方法

4、透射电镜测试方法

5、GPC测试流程

 

 

 

聚合物表面细胞形态分

 

目的意义:

  • 研究细胞在材料表面的粘附、生长和扩展,反映材料界面性质与细胞行为的直接互相作用关系,对合成新材料进行细胞相容性批量筛选。

实验原理:

  • 细胞的粘附、生长、扩展和迁移等细胞行为与材料表面的物理化学性质密切相关,不同材料的表面界面性质微小差异即会影响各种细胞行为。将聚合物在盖玻片表面涂膜,接种培养相应细胞,并应用计算机形态学图像分析系统可识别、检测材料表面生长的细胞数量和相关形态参数,定量分析和评估材料对细胞粘附和细胞形态的影响。

操作方法:

1 材料准备

  • 玻片硅化处理:盖玻片散开,在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,待其冷却后,倒掉盐酸,去离子水漂洗玻片,自然干燥;通风条件下,将单片的盖玻片在2%二甲二氯硅烷(dimethyldichorsilane,DMDC)液中浸几下,竖在架子上干燥;然后,收集于可耐热的petri氏盘(或培养皿)中,用去离子水漂洗数次,彻底清洗;用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好,于180℃烘烤4h以上;冷却至室温后备用。硅化处理后盖玻片,可用于氯仿等溶解的亲油性聚合物的铺膜。
  • 多聚赖氨酸(PLL)包被:盖玻片经严格清洁处理后,95%乙醇脱脂过夜,凉干,以0.5%PLL浸渍数次进行包被,干燥后4℃冰箱保存备用。PLL包被的盖玻片既可用于氯仿溶解的亲油性聚合物铺膜,也可用于极性溶剂DMF等溶解的双亲性共聚物的铺膜。
  •  聚合物涂膜:将聚合物溶解于氯仿或DMF,配制成1%氯仿或DMF溶液,以推片或浸渍方式于盖玻片涂膜,常温干燥30min,真空干燥48h,紫外照射消毒20min后备用。

2 接种细胞

  • 将盖玻片置于六孔板内,每孔先添加3ml含血清培养液。将收获的细胞制成浓度为1×105/ml细胞悬液,每孔添加1ml,使每孔细胞数为1×105,培养24h,于不同时间段,取出玻片,PBS冲洗三次,2.5%戊二醛固定30min,Giemsa染色或1%甲苯胺蓝染色30min,凉干,中性树脂封片,显微镜10倍物镜下按“田”字布点拍摄9张照片。

3 计算机形态识别

  • 以NIH Image J形态识别软件对每张照片进行计算机细胞形态识别和分析。方法:打开(图片文件)→设定标尺→将图片转换为二维图像→形态识别,获得图片内的细胞数量和每个细胞的形态参数→保存结果为TXT文件。识别后的形态参数包括Area,Mean,StdDev,Mode,Min,Max,X,Y,XM,YM,Perim.,BX,BY,Width,Height,Major,Minor,Angle,Circ,Feret等。

4 数据处理与统计分析

(此部分,可选择自己熟悉的统计软件处理,仅供参考学习)

  • 采用Visual FoxPro系统设计的数据接口程序(见图2-2),将每张照片识别后的数据读入、筛选,经分组统计处理后,获得细胞数(每个视野)、细胞平均面积、周长、圆形度、Feret直径等参数。

Visual FoxPro数据接口程序主要原理:

 ***Image J数据分析系统***

  • CREATE CURSOR mytable1(my_group n(2),my_no n(10),my_Label n(10,2),my_Area n(10,2),… my_Circ n(10,2),my_Feret n(10,2))  &&建立临时表mytable1,根据Image J保存的文本文件中分析参数及其所占的字符数,设定临时表的字段和字段长度
  • APPEND FROM  *.txt SDF &&将Image J分析结果,读入数据表
  • CALCULATE COUNT(my_no), AVG(my_Area), STD(my_Area),…, AVG(my_Feret), STD(my_Feret)  TO a, b,…,y, z   &&利用Visual FoxPro的统计函数,分别对所需要的各个参数进行统计分析,获得每张照片的细胞数(COUNT)和每个形态参数的均数(AVG)和标准差(STD)。
  • CREATE CURSOR mytable2(my_image n(2), my_count n(10), my_Area_AVG n(10,2), my_Area_STD n(10,2), …, my_Feret_AVG n(10,2)), my_Feret_STD n(10,2))   &&创建临时表mytable2
  • INSERT INTO mytable2(my_image n(2), my_count n(10),my_Area_AVG n(10,2), my_Area_STD n(10, 2), …, my_Feret_AVG n(10,2))  VALUE(a, b,…,y, z)   &&将上述统计结果读入临时表mytable2
  • COPY TO *.txt SDF   &&将统计结果导出为固定格式的TXT文本文件,该文件内的数据可被读入Excel或Origin等统计软件作进一步的统计分析和绘制统计图表。
  • ***Image J数据分析系统***

 

参考文献:

  • Yang Cui, Yi Liu, Yi Cui, Xiabin Jing, Peibiao Zhang*, XuesiChen.The Nano-Composite Scaffold of Poly(lactide-co-glycolide) andHydroxyapatite   Surface-Grafted with L-lactic Acid Oligomer for Bone Repair. Acta Biomaterialia, 2009, 526802692.

 

  • PeibiaoZhang, Haitao Wu, Han Wu, ZhongwenLù, Chao   Deng, Zhongkui Hong, XiabinJing, XuesiChen. RGD-conjugated copolymer incorporated into composite of   poly(lactide-co-glycotide) and poly(l-lactide)-grafted nanohydroxyapatite for   bone tissue engineering. Biomacromolecules 2011, 12 (7): 2667–2680

 

  • Zhongkui Hong, Peibiao Zhang, Chaoliang He, XueyuQiu, Aixue Liu, Li   Chen, Xuesi Chen and Xiabin Jing. Nano-composite of poly(L-lactide) and surface grafted hydroxyapatite:   Mechanical properties and biocompatibility.    Biomaterials, 2005, 26(32):6296-6304.