"再生"讲堂

1、第104号捐献:对器官捐献与移植的思考?

2、 人类关于再生的最早想法

3、上世纪上半叶颇具盛行的组织疗法

4、组织工程学的建立和发展

5、组织/器官的原位再生

6、什么是再生医学材料?

7、人类新希望:再生医学(央视视频)

8、皮肤创伤与再生修复材料

9、 骨科再生医学材料

10、 神经损伤与再生修复材料

11、 干细胞与再生医疗

12、 生长因子(蛋白或多肽)

待续,请继续关注......

 

3D支架构筑方法

 

  再生医学材料无论是作为体外的组织/器官支架,还是应用于体内组织/器官的再生修复,往往需要具备一定的三维(3D)空间结构。具有特定形状和微观结构、合理孔尺寸和孔隙率的3D支架,能够满足特定组织/器官的重建需要,可为细胞的附着、迁移、增殖、分化以及新组织的形成提供空间支持。孔隙太小,细胞无法进入孔隙或阻碍细胞增殖和扩增;孔隙太大,则细胞无法粘附和聚集,失去支架的作用。因此,支架的制备技术与工艺对于材料的生物医学应用至关重要。

  传统3D支架的制备方法多种多样,每种方法均有各自的特点,但没有一种方法能同时满足所有组织的要求。针对目前3D支架存在的问题,人们正在研究开发新的制备和加工方法,以获得更加理想的支架材料。如近几年刚刚兴起的气体发泡和支架打印,可望为制备新一代的智能型再生医学3D支架(组织工程支架)提供技术支持。

(1) 纤维粘结法

  以PGA纤维无纺毡作为支架材料是组织工程中最早采用的一种方法。作为一种经典的支架材料,目前仍应用于组织工程研究中的各个方面,尤其是有关生物反应器、生物力学模型等方面的研究。PGA无纺毡是经熔融挤出、取向、切梳、针刺等工艺加工成型而得到的。PLGA纤维构成的骨架的优点是表面积大,有利于细胞的粘附和养分的扩散,故对细胞存活和生长有利;缺点是内架结构稳定性不好,其孔的尺寸较大,孔隙率、比表面积不可控。因此,有必要对此加以改进,将无纺毡中互不相连的纤维粘结起来。连结纤维的方法主要有两种。

  一种是Mikos等[35]发明的纤维固定技术。将PGA纤维浸入到PLLA的氯仿溶液中,待溶剂挥发后,PGA纤维网嵌入到PLLA中,将混合物加热至两种聚合物的熔点以上。由于熔点不同,PLLA首先熔融,充满PGA纤维网络所有空隙,其作用是稳定PGA纤维和防止PGA熔融时纤维网络结构塌陷。继续升温,PGA纤维熔融后于交叉点处粘结在一起。选定一种只能溶解PLLA的溶剂(如二氯甲烷),将其溶解除去PLLA,即可得到高度多孔的PGA网状支架。此方法获得的孔隙率和孔径一般分别高达81%和500μm。

  另一种方法是通过雾化或喷雾对纤维表面进行涂层[36]。由于氯仿不是PGA的溶剂,以喷雾方式将PLLA或PLGA氯仿溶液喷涂到PGA纤维网表面,而PGA纤维结构不会发生变化。溶剂挥发后,PGA纤维由PLLA或PLGA在交叉点处粘结起来。这种复合结构综合了纤维的力学性能和PLA的表面特性,其孔径与前一种方法相近。

  纤维粘结技术制备的多孔支架,特点是孔隙率高,孔与孔之间连通,具有一定力学性能,适用于组织再生。缺点是需用到有机溶剂,第一种方法还需要高温加热。有机溶剂的残留及高温过程对引入生长因子类的生物活性分子和细胞是非常不利的。

(2)溶液浇铸/粒子沥滤法

  溶液浇铸/粒子沥滤技术是继PGA无纺织物支架之后的另一种传统的多孔支架制备方法。其优点是通过选择一定粒径分布的水溶性粒子和调节粒子与聚合物的比例,可形成孔径和孔隙率可控的聚合物骨架。致孔剂通常为盐(NaCl等)或糖(蔗糖等)等可溶性粒子。

  方法是将聚合物(PLLA或PLGA)溶解在CHCl3或CH2Cl2 中,然后将溶液浇铸到充满致孔剂的培养皿上。待溶剂挥发后,将聚合物/盐混合物在水中沥滤两天以去掉致孔剂,从而得到不含粒子的聚合物骨架。

  骨架的孔隙率由所加盐的用量来控制,孔的直径由盐晶粒的大小决定[28]。通常当盐的重量百分比达到或超过70 %时,孔与孔之间高度相互连通。然而,泡沫暴露在空气中的外侧部分比浸润在陪替氏培养皿中的部分粗糙,即两部分具有不同的形态,故采用该技术不能制备太厚的骨架,一般在2mm以下。对此的改进是将块状的聚合物/盐混合物在高于PLLA的熔点或PLGA的玻璃化温度上模压成圆柱体形状,在混合物用水沥滤之前,将圆柱体切割成所需厚度的片状,片状的聚合物/盐复合体经水沥滤后,采用层叠技术将片状骨架叠在一起,从而可更为精确地控制支架的厚度和提高泡沫表面的规整性。然而,需考虑模压过程中聚合物的热降解问题。

  这种方法的缺陷是往往存在闭孔结构和盐/糖粒子残留等问题,这对细胞的生长不利。为此,Chen等[37]采用冰晶作为致孔粒子,将粒子沥滤与冷冻干燥法相结合,发展了一种新的多孔支架制备方法,获得了高孔隙率的PLLA多孔支架,并避免了盐/糖粒子残留对细胞生长的影响。其孔结构分布均匀且互相连接。然后,PLLA支架进一步与胶原复合,经戊二醛交联后,获得了一种PLLA孔内含有胶原微孔海绵的复合支架。

  为避免残留的溶剂对细胞产生毒性影响,Jung等[38]将上述的溶液浇铸法改为烧结法(sintering)制备了多孔支架。具体方法是:采用30-40mm的PLA粉末与NaCl粒子混合,在模具内先以150Mpa室温下挤压3min,然后以稍高于PLA熔点(190℃)的温度(210℃)继续挤压30min,冷却后水浸沥48h去除盐粒子,每6h更换1次水。与溶液浇铸法比较,所制备的多孔支架孔尺寸更均一,力学性能明显增强。

(3) 相分离/冷冻干燥法

  相分离/冷冻干燥法是指聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温冷冻过程中发生相分离,形成富溶剂相和富聚合物相,然后经真空冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法[39]。按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。其特点是:1)避免了高温,有利于生物活性分子如蛋白质生长因子或分化因子的引入和控制释放;2)孔比表面积大,易操作;3)通过调整油水比、聚合物分子量来控制孔结构。支架孔隙率可达90-95%,孔径范围在0.01-200um[40]

(4) 超临界CO2气体发泡法

  超临界CO2气体发泡法,是指将聚合物挤压成型(块或片),浸泡在高压二氧化碳中直至饱和,甚至超临界状态,然后迅速降至常压,气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长,形成多孔支架。

  该方法的优点是:1)避免了在制备聚合物支架时使用有机溶剂;2)还可避免使用高温,有利于在温和的条件下引入生长因子。

  发泡法中影响孔隙率和孔结构的因素主要有聚合物结晶性和分子量、平衡时间、放气速率等。结晶性聚合物PLLA和PGA难以发泡,无定型聚合物PLGA易发泡,孔隙率最高可达95%;聚合物分子量越高越难以发泡,孔隙率越低;在高压气体中平衡时间越长,孔隙率越高;放气速率对孔隙率影响较小。血管发生生长因子,如血管内皮细胞生长因子被相继复合入PLGA,并以可控的方式释放。尤其重要的是,被释放的生长因子的活性保持在90%以上[41]

  除了CO2,氮气(N2)和氦气(He)也被尝试用于聚合物发泡,但均未能成功。缺点是闭孔结构较多,孔隙率与孔径均偏小[42]。若将发泡法与粒子浸出法相结合,则可制得相连的开孔结构的多孔支架[43]

(5) 化学发泡法

  制备多孔支架的另一种方法即化学发泡法。化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液与碳酸氢铵粒子混合至粘糊状并加入到模具内,待溶剂部分挥发后浸入热水中发泡,使氨和CO2挥发,最后经冷冻干燥可得到高孔隙率和互相连接的多孔支架[44]

(6) 静电纺丝技术

  静电纺丝是一种简便易行的新型组织工程多孔支架制备方法。电纺支架具有独特的微观结构和适当的力学性能,由于具有与天然ECM相近的纳米级结构,电纺支架能够仿生ECM的结构特点使之有望成为理想的组织工程支架。

  电纺最早出现于1934年Formhals在美国的一篇专利中首次介绍了利用静电斥力获得聚合物纤丝的方法[45]。其原理是利用外加电场力使聚合物溶液或熔体克服表面张力在纺丝喷头毛细管尖端形成射流,当电场强度足够高时,在静电斥力、Coulomb和表面张力的共同作用下,聚合物射流沿不稳定的螺旋轨迹弯曲运动,在几十毫秒内被牵伸千万倍,随溶剂挥发,射流固化形成亚微米至纳米级超细纤维[46]

  目前已有超过100多种天然和人工合成高分材料被成功地电纺成纳米纤维,所得单根纤维的直径从40-200nm,甚至可以跨越10-104nm的量级,即从微米、亚微米直至纳米尺度范围,并用于组织工程研究[47]

  影响电纺丝的因素包括过程操作参数(电压、流速、接收距离及温度、湿度、空气流动速率等)和系统参数(聚合物分子量、分子量分布、分子链结构、溶液浓度、溶剂种类和配比、溶液的性能,如粘度、导电率、界面张力等)。由于电纺丝的孔尺寸较小,一般在100mm以下,甚至更小,细胞很难进入支架内。而且,电纺丝的热稳定性和力学支撑性均较差。

  因此,人们正在尝试新的纺丝方法,以使其适合组织工程的需要,如将聚合物与水溶性高分子同时进行电纺丝制备复合支架,以求获得更大的孔径。

(7) 计算机辅助的快速成型方法

  近年来,快速成型技术(Rapid Prototyping Manufacturing,RPM)用于组织工程支架的制备越来越受到人们的关注。

  快速成型技术指首先经计算机辅助设计(Computer Aided Design,CAD)获得三维模型,然后根据工艺要求进行分层,将三维模型分割为连续的二维截面图像,通过不断重复堆积和逐层加工,一步获得同时具有预先设计的孔结构和外形的三维多孔支架。包括立体平板印刷(stereolithography apparatus,SLA),激光烧结(laser sintering, LS),层压技术(laminated object manufacturing, LOM),熔融堆积成型法(fused deposition modeling,FDM)和三维打印技术(three-dimensional printing, 3-DP)等。

  通过这些技术,可以获得类似人体组织微结构和器官外形的支架材料和实现组织工程器官支架制备的个性化[48,49]。例如,对某一骨缺损患者,可先行X线或CT扫描,获得缺损部位的影像,经计算机CAD软件设计出三维骨模型,通过打印技术制备出特定尺寸和外形的骨支架,用于患者的骨缺损修复。

  三维打印技术还可用于对支架进行选择性修饰来调控一些特殊类型细胞的三维空间分布,引导复杂组织的有序再生。为此,Park等采用打印技术,先将PLLA的表面经PEO-PPO共聚物修饰,结果肝细胞和成纤维细胞均不能在其表面粘附生长;然后,将针对肝细胞唾液酸糖蛋白受体的糖基配体通过共价方式连接到PEO链末端,出现了选择性地粘附肝细胞现象[50]