"再生"讲堂

1、第104号捐献:对器官捐献与移植的思考?

2、 人类关于再生的最早想法

3、上世纪上半叶颇具盛行的组织疗法

4、组织工程学的建立和发展

5、组织/器官的原位再生

6、什么是再生医学材料?

7、人类新希望:再生医学(央视视频)

8、皮肤创伤与再生修复材料

9、 骨科再生医学材料

10、 神经损伤与再生修复材料

11、 干细胞与再生医疗

12、 生长因子(蛋白或多肽)

待续,请继续关注......

 

组织工程化人工皮肤的研究现状

 

 

(一)人工表皮

1.  自体角质形成细胞(Kc)膜片

  自体皮移植物虽然理想,但对于大面积烧伤患者的治疗,往往受皮源限制。许多研究者开始寻找体外培养角质形成细胞的方法[65,66]

  1975年Rheinwald和Green[66,67]首先提出了上皮细胞的培养技术,解决了上皮细胞体外的传代扩增的难题,使体外培养人工皮片成为可能。从患者取得小块皮肤,体外培养上皮细胞,经2~3周培养,即形成复层上皮,再回植患者,解决了皮肤缺损的修复。

  1984年Gallico[68]等报道了培养的自体Kc膜片在大面积深度烧伤中的成功临床应用,标志着开创了烧伤治疗的一个新时代。这种培养的自体角质形成细胞膜片开始应用于临床全厚烧伤创口的覆盖[69]。优点有:能用自体细胞提供大面积的永久性创面覆盖,成功重建表皮,阻止水分丢失和微生物污染。目前,移植培养的自体Kc技术在美国、澳大利亚、欧洲等国家和地区已常规应用于烧伤治疗中。在肉芽创面上直接移植培养的自体Kc膜片的接受率(take rate)平均为60%左右[70]

  然而,过去20年的临床应用表明,自体人工表皮存在明显缺陷:必须取患者的皮肤活检标本和2~3周的准备时间;培养后收缩明显,且薄而脆,不宜临床操作;移植后耐磨性差、易起疱,尤其不适于全厚真皮损伤的创面;移植成功率主要与创面细菌污染程度有关;费用昂贵;获得的临床效果差于自体皮片移植[71-75]

  为解决单纯人工表皮的缺陷,人们意识到需在皮片下方增加支持物,以满足临床上一定厚度、韧性和可操作性的要求。Horch[76,77]报告以纤维蛋白为载体,培养上皮细胞,植入裸鼠皮肤缺损,伤口愈合良好。Medalie[78]和Butler[79]则分别以无细胞的尸体真皮和人工合成的胶原海绵为载体,也较好地解决了单纯皮片所遇到的问题。为减少人工表皮的体外培养时间,Horch[80]将上皮细胞接种在胶原膜上,几天后细胞融合成单层即进行移植。与常规作法相反,表皮层向下贴附于创面,表面为胶原膜,移植后表皮细胞可在移植区继续增殖,缩短了创面愈合周期。

2.  异体Kc膜片

  培养的异体Kc因其可及时应用和来源不受限制等优点,已成功用于临床[81]。许多研究表明培养的异体Kc膜可作为暂时性创面覆盖物,刺激创面愈合,直至被自体Kc所替代。由于异体Kc存在免疫排斥反应,不适于大面积深层创面的治疗[67]

 (二)人工真皮

  机体对真皮缺损的应激性反应是,首先在胶原暴露部位血小板聚集,脱颗粒,并介导一系列炎症反应。创面若未及时清创和关闭,则发生炎性浸润,肉芽组织增生,成纤维细胞迁移,胶原过量表达,肌成纤维细胞介导的收缩等[82]。这一过程的主要作用是防止细菌侵入和关闭缺损,而不是缺损组织再生,可使全厚创面缩小10%。其代价是,轻则创面挛缩和形成较大的疤痕,重则留下慢性开放性创口。两者均可给患者造成长期的病痛和永久性的功能障碍。

  因此,研究开发永久性的真皮替代物是解决这一临床问题的关键。设计真皮替代物,需考虑以下几个临床特点:1)游离厚皮移植物的真皮层越厚,移植收缩越小;2)全层皮移植物的收缩极小;3)全厚真皮损伤是通过收缩和疤痕产生次表皮疤痕组织进行修复,与原正常真皮不同;4)浅层真皮缺损的创口,形成的疤痕较小;5)烧伤创面的开放时间决定了烧伤患者病程的长短。据此推测,是真皮传递信息给创口,以调整愈合过程。因此,真皮替代物需同时具备:1)控制炎症和收缩;2)引导自体真皮再生。

  目前的几种永久性人工真皮,是从不同的方式设计制作。

  ①Integra是由Burke 和Yannas设计开发的一类无细胞人工真皮[44](见前述)。

  ②Bell等[83,84]将成纤维细胞混入胶原凝胶,于体外进行组织培养,形成具有生物活力的人工真皮。成纤维细胞在胶原凝胶内扩增并重新组织胶原形成一收缩的真皮基质,同时分泌自身的胶原和其它基质。胶原蛋白的浓度和细胞密度决定了收缩程度和最终的面积。动物实验表明,这种人工真皮可用于全厚皮损伤的移植修复,并可支持表皮细胞的生长形成表皮层。

  ③Dermagraft是ATS开发的另一类组织工程化的真皮替代品[85,86]。与Integra相比,Dermagraft在人工真皮网架内增加了活细胞成分,将增殖能力强的新生儿包皮成纤维细胞和胶原种植于生物可降解材料上,Fb可在网孔内增殖,分泌胶原、氨基多糖等基质成分和生长因子等[87,88]。免疫组化证明[89-91]:其间充满I、III、IV型胶原,弹性蛋白、纤维粘连蛋白(FN),脱氧胆酸及核心蛋白多糖、巢蛋白等,其中FN含量较高,与胎儿皮肤相近。FN有促进细胞游走和基底膜形成的作用[92-95]。Westernblot检测有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在,聚合酶链反应(PCR)确认有胰岛素样生长因子1,2及血小板源性生长因子(PDGF)的mRNA存在。这些因子同创面分泌的一些细胞因子相互作用,刺激血管的新生及成纤维细胞的长入[96-97]。其中,Drmagraf-TC内层由三维尼龙丝构成支架材料,表面亦采用硅胶膜,移植后可在移植部位保持6周,而异体皮仅能保持2~3周。Dermagraft-TM则使用可降解的聚羟基乙酸作为真皮支架,移植后支架成分逐渐被降解,种植的Fb则产生新的真皮基质。临床证明,Dermagraft可有效用于糖尿病溃疡的治疗[71]

(三)人工复合皮肤

  理想的皮肤替代物应具有表皮和真皮结构,即位于表层的表皮细胞和位于真皮层的成纤维细胞,能够同时修复所缺失的真皮和表皮层。因为这两种成分不仅影响皮肤的功能和外形,而且具有相互影响的机制,促进彼此的分化。

  ①Apligraf是在Bell等[83,84]研究基础上开发的一种包含上皮细胞和成纤维细胞的双层组织工程皮肤,是目前较成熟的人工皮肤。其成纤维细胞和角质形成细胞来源于患者自身皮肤,具有更好的组织相容性。真皮层是由Fb、牛I型胶原、血清等形成凝胶,表面接种上皮细胞,体外培养7~10天形成含上皮角化层的人工复层皮肤。将其用于治疗老年人静脉性溃疡,溃疡愈合快,临床亦未见对异体细胞所构建人工皮肤的排斥反应。但由于该方法,从患者身上取细胞到形成产品需要数周,为及时关闭烧伤创面,需要先由其它皮肤替代物暂时覆盖[98-100]

  ②另一种Apligraf,其细胞成分均来源于新生儿包皮,经体外培养所得,移植后受体接受率达100%。移植后28天,收缩率为39%,表皮细胞分化良好,移植后14天可见连续的基底膜形成[101]。该代用品1997年在加拿大已获准进入市场,正在向FDA申请进入美国市场[102]

  当然,以Bell方法构建的人工皮肤及其同类产品在烧伤治疗中仍然存在缺陷[103],目前尚未被FDA批准应用于临床。

  ③Boyce等[104]则在组织工程复层皮肤的应用上作了进一步探索。首先,对大面积烧伤患者及时进行创面清除术并以Integra覆盖创面;同时,从患者身上取得成纤维细胞和角质形成细胞,在类似Integra的胶原海绵上接种自体成纤维细胞,体外培养一定时间直至成熟形成真皮层,然后将体外扩增的角质形成细胞接种于真皮层表面。经过一定时间培养和将表皮层暴露于气液界面,最终形成一种双层的自体组织工程皮肤替代品,并移植于Integra的新生真皮之上。经过6个月观察,未见疤痕形成。该方法虽然昂贵,但通过Integra技术与组织工程技术的结合,充分展示了未来组织工程皮肤的应用前景。

  近年来国内组织工程皮肤研究进展较快。曹谊林等[105]将体外培养的猪自体表皮细胞与成纤维细胞,分别与30%氧化异丙烯F-127混匀成细胞悬液后,种植聚羟基乙酸(PGA)形成细胞-生物材料双层皮肤替代物,直接用于修复全层皮肤缺损。结果,第1周新生组织即出现表皮与真皮双层结构,特殊染色观察到连续的基底膜。修复后第8 周组织工程化皮肤的形态结构均与正常皮肤相似。鲁元刚等[106]则将成纤维细胞混入鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白等复合凝胶材料内,再于表面接种表皮细胞,形成复合壳多糖人工皮肤。

  吉林大学再生医学研究所自1992年开始开展组织工程人工皮肤的研究,先后成功构建了大鼠人工真皮、大鼠复合人工皮肤(1995)[107-109]、人类人工表皮、人类人工真皮和人类复合人工皮肤(1998)[110]。该复合人工皮肤是以胶原网架为载体,先后接种成纤维细胞和表皮细胞,经过3-4周体外培养,形成的复层皮肤具有与人类正常皮肤相类似的形态结构特点和新陈代谢过程。随后,应用壳多糖网架构建成功的复合人工皮肤组织,移植于裸鼠,取得较好的修复效果[111-112]

(四)存在的问题及展望

  虽然组织工程皮肤的研究已取得可喜的进步,并开始应用于临床,但仍然存在一些问题:1)组织工程皮肤移植虽不引发临床常见的排斥反应,但一般认为它将最终为受体自己的组织所取代;2)目前的体外培养过程周期仍较长,难以及时满足临床需要[113];3)移植中发现由于组织工程皮肤没有血管系统供给营养,表面的上皮容易坏死脱落;4)目前组织工程皮肤的韧性及机械性能同天然皮肤仍有较大的差距[114]

  理想的人工皮肤应具备以下特点:1)经济、易获得、体外可保持较长时间;2)耐用且可随时得到,具有柔韧性和一定的机械强度;3)有防细菌侵入及体液丢失的屏障功能;4)移植后能随创面生长,但不会过度增生形成疤痕;5)安全、不携带病毒[113]

  随着材料科学和组织工程技术的进步与合作,可望研制出一种功能与自体皮肤相同、具有表皮和真皮结构的皮肤替代产品[44]