"再生"讲堂

1、第104号捐献:对器官捐献与移植的思考?

2、 人类关于再生的最早想法

3、上世纪上半叶颇具盛行的组织疗法

4、组织工程学的建立和发展

5、组织/器官的原位再生

6、什么是再生医学材料?

7、人类新希望:再生医学(央视视频)

8、皮肤创伤与再生修复材料

9、 骨科再生医学材料

10、 神经损伤与再生修复材料

11、 干细胞与再生医疗

12、 生长因子(蛋白或多肽)

待续,请继续关注......

 

创伤修复的调控因素与分子机制

   

  皮肤创伤后的修复过程与多种细胞、基质成分、血管及多肽生长因子等众多因素密切相关,而一些炎性趋化因子、基质分子和某些细胞因子在不同修复阶段调控皮肤内的细胞功能、细胞外基质分泌、皮肤重建等方面发挥重要作用。

(一)细胞外基质(ECM)

  ECM(extracellular matrix)是指由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质,通常位于上皮或内皮细胞下层、结缔组织细胞周围,构成复杂的网架结构,为组织、器官甚至整个机体的完整性提供力学支持和物理强度。

  在简单的多细胞生物系统中,维系各个细胞之间相互关系的ECM,可能仅仅就是基底膜结构。在更为复杂的动物机体中,细胞外基质可有多种存在形式,如皮肤、骨、肌腱、韧带、软骨以及广泛存在的基底膜等。

  众多研究表明,ECM除了为组织和机体提供力学支持和物理强度的组织部分,还对其所作用的细胞类型中基因表达的方式,如细胞的粘附、扩散及移行等表现产生影响。

  ECM成分主要可分为胶原、蛋白聚糖和糖蛋白三大类。

1. 胶原

  胶原(collagen)是一类由不同亚基组成的糖蛋白(glycoprotein),是ECM的主要成分。每一种胶原蛋白都由三个不同的亚基组成,或称之为a链多肽。每一条a链自身为左手螺旋构型,三者又相互缠绕在一起形成右手超螺旋结构。胶原蛋白之间的差别就是组成各种胶原蛋白的亚基,或称为a多肽链的一级结构不同。到目前为止,已发现30余种胶原亚基的编码基因。这些亚基以不同的方式组合,形成至少16种不同的胶原蛋白质分子[118]

  在创伤修复过程中,机体可以通过胶原的合成、降解和吸收对创伤愈合和愈合后的组织进行改造,实现组织修复。纤维连接蛋白参与创伤修复过程的始终,它通过与多种细胞和细胞外基质相互作用,加速创伤修复。

  胶原由三个相同或不同的前a链组成的均一三聚体(homotriplex)或异三聚体结构。I~XVI型胶原的亚基组成、超分子结构、分子量以及组织分布如表4-1所示。

表4 -1 各型胶原结构与分布特点[118]

型号

亚基组成

超分子结构

链分子量

组织分布

I

[a1(I)]2a2(I)

大直径67nm条状纤维

95000

骨、角膜、皮肤和肌腱

 

[a1(I)]3

67nm条状纤维

95000

肿瘤、皮肤

II

[a1(II)]3

67nm条状纤维

95000

软骨、玻璃体

III

[a1(III)]3

小直径67nm条状纤维

95000

皮肤、动脉、子宫、胃肠道

IV

[a1(IV)]2a2(IV)+a3(IV)、a4(IV)a5

(IV)链

非纤维网状结构

170000-180000

基底膜

V

[a1(V)]2a2(V)、[a1(V)a2(V)a3(V)]

[a1(V)]3

9nm直径非条状纤维

120000-145000 

胎盘、骨和皮肤

VI

[a1(VI)a2(VI)a3(VI)]

5~10nm直径球状微原纤维周期长度100nm

140000-340000

子宫、皮肤、角膜、软骨

VII

[a1(VII)3]

锚定纤维

170000

羊膜、皮肤、食管

VIII

[a1(VIII)2]a3(VIII)

非纤维六边晶格

61000

地塞麦氏膜内皮细胞

IX

[ a1(IX)a2(IX)a3(IX)]

FACIT、非纤维

68000-115000

软骨、玻璃体

X

[ a1(X)] a 3

非纤维六边晶格

59000

沉钙软骨

XI

[al(Ⅺ)a2(XI)a3(XI)

细纤维

110000-145000

软骨、脊椎盘

XII

[ a1(XII)]3

FACIT、非纤维

220000、340000

皮肤、肌腱、表皮

XIII

[ a1(XIII)]3

 

62000-67000

内皮细胞、表皮

XIV

[ a1(XIV)]3

FACIT、非纤维

220000、340000

皮肤、肌腱、软骨

 

   I、Ⅱ和Ⅲ型胶原是所谓经典的纤维形成胶原,三种胶原约占体内总胶原的80%~90%。V和Ⅺ型胶原由于与I~Ⅲ型胶原之间有同源性因而也视为纤维胶原。其它非纤维胶原与其它形态的细胞外基质的形成有关。Ⅳ型胶原可形成三维网状结构,Ⅵ型纤维形成球状结构,Ⅶ型胶原形成反平行二聚体、再形成锚定纤维,Ⅷ型胶原则形成六边晶格状结构。

  目前皮肤中大约可检测到6种胶原,其中以Ⅰ型、Ⅲ型胶原为主。在创伤愈合早期,Ⅲ型胶原含量常高于正常,随着创伤组织逐渐愈合,Ⅲ型胶原水平逐渐下降而Ⅰ型胶原含量逐渐增高[116]

  胶原产生的量和胶原分子间交联程度决定正常组织和伤口的大小,伤口张力迅速增高发生在创伤修复的第二期肉芽组织增生和表皮移行期。伤口收缩率在伤口张力上升至最高又降到峰值的80%时达到最大。任何改变胶原合成和降解的平衡及胶原分子交联的因素都将影响到伤口张力强度。

2. 蛋白聚糖(proteoglycan, PG)

  除胶原外,皮肤细胞间质还包括结构性蛋白(层粘连蛋白、纤维连接蛋白),透明质酸、硫酸软骨素等蛋白多糖。这些基质成分作为趋化物质,吸引炎细胞、成纤维细胞(Fb)、血管内皮细胞向损伤区域移动;促进Fb迅速合成和分泌大量胶原,引导上皮细胞覆盖创面;并与胶原分子结合,相互作用,相互影响,共同沉积于基质中。

  PG是一系列由一个核心蛋白分子与一个或多个氨基聚糖(glycosaminoglycan ,GAG)侧链相结合的蛋白家族。PG在动物细胞中广泛分布,参与一系列不同的生物学功能。PG分子在细胞外与细胞膜呈结合状态;也可以颗粒状态贮存在细胞内。绝大部分的PG分子与ECM之间有着极为密切的关系,但也有些PG分子与ECM无关。

  PG分子的结构相差较大。不同PG分子,除了核心蛋白的结构不同,其GAG分子的类型和大小也往往不同。在不同的发育阶段,细胞表达不同类型的PG分子。氨基聚糖复杂的碳水化合物类型主要包括硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮肤素(dermatansulfate)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)、硫酸角质素(keratansulfate)和透明质酸(hyaluronan,HA)。这些分子的共同特点是由2个不同的糖形成的双糖重复序列,其中一个为己糖,另一个为己糖胺。由于双糖键以及硫酸化位置的不同,导致这些氨基聚糖链的结构也不同。

3.  整合素

  整合素(integrin)是黏附分子的主要家族,介导Fb-ECM的相互作用。整合素是一组细胞表面糖蛋白,是由α和β亚单位经非共价键连接而成的异二聚体糖蛋白,其配体结合区能识别相应配体上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gig-Asp,RGD)。而ECM成分FN、LN、I型胶原等结构中均含有RGD序列,ECM即通过这些RGD序列与Fb表面整合素的配基结合区特异性结合。α、β亚单位结合后可决定整合素的结合活力和特异性,其功能也受表达细胞的影响。Gailit等[119]研究了介导成人真皮Fb与创面基质蛋白相互作用的整合素。整合素α3β1、α4β1、αvβ3和αvβ1能与纤连蛋白结合;整合素αvβ1、αvβ3则是VN受体。并认为,培养的成人真皮Fb可表达α3β1、α5β1、αvβ1,证实在创伤修复早期的ECM中,可与FN、VN和纤维蛋白结合[120]。αvβ5还能调节细胞表面结合的VN的分化与退化,而αvβ3则无此功能[121]。αvβ5的这种功能有利于ECM的塑型,因为二者接触处是相对的紧密部位,Fb快速向创面迁移需要αvβ5来调节不同的细胞内信号传导途径。

(二)细胞与细胞因子

1. 表皮细胞

  皮肤表皮细胞(EC)属于上皮细胞类型,除具有一般的上皮细胞特征外,可分泌角质,具有很强的角质化特征,以此作为保护上皮,完成表皮的功能。

  整个表皮从基底层到表面可分为五层,即基底层、棘层颗粒层透明层角质层,代表了表皮细胞逐步衰老的分化过程。仅有基底层内角质形成细胞(Keratinocyte,Kc)的细胞分裂比较活跃,不断产生新细胞并向浅层推移,以补充衰老、脱落的角质细胞

  角质形成细胞(Kc)既可产生多种细胞因子又是多种细胞因子作用的靶细胞。特别是其分泌的多种细胞因子,在创伤修复中起着十分重要的作用。在炎性因子和损伤因子的刺激下,Kc转化为活性Kc并释放大量细胞因子。这些因子对免疫细胞、血管内皮细胞、Fb等具有明显的趋化活性和刺激生长活性,并刺激间质细胸增殖、分化、促进细胞间质和毛细血管的生成[122]

2.  成纤维细胞

  成纤维细胞(fibroblast,Fb)是皮肤真皮层的主要细胞成分,由胚胎时期间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。Fb可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。

  组织损伤后愈合过程中的一个重要病理特征是细胞外基质(ECM)合成增加并在伤口周围聚集[123]。有关研究已表明Fb是合成和分泌ECM的主要细胞[124]

  伤口愈合中,部分Fb表达Ⅰ、Ⅲ前胶原mRNA增多[125]。创面愈合过程中存在着高产量胶原的Fb异常亚群,这种高产量胶原亚群的激活机制受多方面因素的调控。

  随着分子生物学技术的日益发展,人们逐渐认识到ECM-Fb间的作用在纤维化过程中的意义。ECM不仅构成器官和组织结构的框架,还直接与多种细胞(如Fb、血管内皮细胞、Kc、单核细胞等)的迁移、趋化、增殖和分化有关。

  整合素亚族是介导Fb与ECM作用的最主要的粘附分子,细胞粘附分子与ECM结合后的生物学效应主要表现为直接诱导Fb的移行和增殖;或者间接激发其它免疫活性细胞及由此引起的细胞变形与运动,从而产生更多的胶原蛋白、血管生成因子或Fb生长因子,刺激毛细血管生长,加速伤口愈合[126]

  有文献报道ECM与整合素结合后可能发生粘附分子在细胞表面成簇、肌动蛋白合成及表达的变化。

  β1整合素由α5、β1两个亚基组成。文献报道,伤口愈合时Fb表面整合素α5、β1亚基较正常皮肤真皮Fb的表达增多,表明Fb表面粘附分子的高表达对组织损伤后伤口愈合有一定的促进作用。Dhawn等[127]的研究表明粘附状态下小鼠NIH3T3 Fb胶原基因表达较细胞悬浮状态时明显增加,提出粘附分子表达可随ECM-细胞间相互作用的变化而自我调控。

(三)成纤维细胞(Fb)与细胞外基质(ECM)的相互作用

1.  Fb表型与ECM合成和收缩

  ECM和许多细胞因子可调节Fb表型。Gabbiani等[128]认为,在伤后2周,创面Fb即可发育成具有平滑肌细胞特征的表型,即肌成纤维细胞(myofibroblast,MFb),它与后期ECM收缩有关。伤后3d,创面内纤维素凝块中无Fb浸润,其中仅有FN和VN作为Fb增殖、迁移和合成ECM的暂时性载体[129],此时Fb尚不具备迁移能力,因其动力装置(细胞骨架)对细胞运动有抑制作用,也可能与细胞迁移所需的表面受体不足有关。3d后Fb由静止型向迁移型转换,并向创面中心迁移,同时大量增殖,胶原合成增多。胶原合成表型的Fb的超微结构特征是含有丰富的粗面内质网和高尔基体。伤后10d,用Maddon染色,胶原性ECM变成肉芽组织永久性成分,且纤维蛋白开始浓缩成疏松的束状,Fb表面可出现αv和α5β1二种整合素表达[130]。伤后14d,ECM可发生收缩,与Fb向MFb表型转换有关。Fb通过其伪足的伸出、回缩而收缩其周围的胶原基质,创面中MFb伸出的伪足与Fb或ECM接触即收缩。当细胞-基质复合体置于增高张力状态下,MFb沿张力线拉长。在早期,由于胶原纤维排列的多向性,Fb的胞质沿这些纤维运动并产生多向性突起而呈星状。随着Fb与胶原纤维的相互作用,胶原纤维改构,其排列由多向性转变为单向性。Fb通过α2β1整合素调节ECM收缩,细胞内产生的收缩力量使基质变形,使定植的细胞再迁移。创面愈合后MFb通过细胞凋亡(apoptosis)而死亡、消失,表现为凋亡细胞数量急剧增加[131]。在某些细胞因子或生长因子的异常刺激下,Fb功能活跃,MFb持续存在,导致ECM大量沉积而形成瘢痕增生和挛缩。

2. ECM对Fb功能的影响

  FN及其片段能促进Fb增殖,使停止生长的Fb重新合成DNA,进入细胞周期[2]。而对LN及其片段的研究表明,LN短臂内部杆状片段含丰富的半胱氨酸,具有“EGF”样重复单位,该结构在其它几种ECM中也存在,在空间结构上有利于蛋白质相互作用。Gauss-Muller等[132]证实FN对Fb、巨噬细胞具有趋化作用,且依赖于FN-Fb间的黏附,通过此黏附作用,细胞膜蛋白和磷酯进行转甲基反应,细胞骨架中微丝微管收缩,使细胞迁移。此后进一步证实,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及其降解产物、胶原酶降解片段对Fb均有趋化作用。真皮基质中的蛋白多糖(proteoglycans,PG)可抑制Fb功能[133],其中含量较多的是硫酸软骨素B,包括DS-PGⅠ(biglgean)和DS-PGⅡ(decorin)。Decorin在培养细胞中可抑制转化生长因子β(TGF-β),从而推测Decorin对Fb的抑制作用是通过TGF-β完成的[134]。胶原分泌到细胞外,其裂解产物前胶原肽在转录和翻译水平负反馈抑制Fb合成胶原[135]。创面愈合后,这种负反馈抑制可能减弱乃至消失,使ECM过量沉积而形成增生性瘢痕。

3. Fb-ECM相互作用的调控因子

  随着Fb和其它细胞迁移至伤口部位,并分裂增殖,伤口处ECM沉积,Fb、内皮细胞和Kc持续合成分泌生长因子,如PDGF、TGF-β、FGF、EGF 等,使细胞持续增殖,ECM合成及新生血管形成。TGF-β对皮肤创伤的正常修复起着重要作用,如在创伤愈合后仍持续发挥作用,很可能形成增生性瘢痕。TGF-β刺激Fb合成ECM,同时抑制胶原酶的产生,并增加胶原酶抑制剂含金属蛋白酶(TIMPⅠ、Ⅱ)和α-巨球蛋白的组织抑制物的产生[136]。烧伤后增生性瘢痕组织中,Ⅰ、Ⅱ型前胶原及TGT-βmRNA较正常皮肤表达明显增加。PDGF是血清中促进Fb 分裂最具潜力的促有丝分裂原,在损伤早期即由血小板释放。PDGF对体外培养的Fb具有趋化和增殖反应,还可刺激Fb合成胶原并使胶原酶活化,调节ECM的更新。同时,促进Fb向MFb表型转换,并获得表达a-平滑肌肌动蛋白的能力,与创伤愈合后ECM收缩和瘢痕挛缩有关[137]。伤后4~5 d,迁移的Fb表达体外黏连蛋白受体,与FGF作用有关,促使Fb向创面趋化。同时,Ⅰ型前胶原颗粒出现在Fb胞浆中,FGF可抑制胶原基质的收缩,其机制与蛋白激酶C激活有关[138]。肿瘤坏死因子(TNF)对Fb增殖具有促进和抑制双重作用,但对ECM合成具有促进作用。γ-干扰素(γ-INF)则可抑制Fb增殖和ECM合成[139]

  近年来,作为生物体内重要的信息分子和效应分子的一氧化氮(NO)在创伤修复中的作用日益受到重视[140]。局部组织中,NO是活体细胞在一氧化氮合酶(NOS)的催化下,以L -精氨酸为底物,在有氧条件下生成的小分子物质。在正常皮肤Kc、血管内皮细胞和真皮Fb均可观察到NOS活性[141-142]。Schaffer等[143]认为,NO可促进创面胶原沉积,并加强创面愈合的机械张力。在创伤早期,NO具有舒张血管作用,并促进血管再生,有利于创伤的正常修复。在修复晚期,因ECM过度沉积而形成的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中,NOS表达却下降[144-145]。局部组织中,NO合成量减少,从而引起瘢痕组织中Fb异常增殖,ECM过量沉积。病理性瘢痕组织中NOS表达及NO合成减少的机制及意义尚未完全明了,可能与TGF-β抑制NO释放或组织中缺乏酶底物(L-精氨酶)致NO合成量下降有关。可以推测局部组织细胞合成分泌的NO,可能抑制Fb过渡增殖,NO替代疗法,也许可为防治增生性瘢痕提供一条新的途径。