一、实验室安全事项

1、化学实验注意事项。

2、生物实验注意事项。

3、国内外实验室事故案例与原因。

 

二、生物、医学实验

1、聚合物表面细胞形态分析
2、MTT实验
3、核酸、蛋白电流
4、实时定量PCR
5、碱性磷酸酶检测
6、共聚焦显微镜免疫荧光分析
7、钙沉积染
8、生物矿化实验
9、组织细胞固定方法
10、动物模型

 

三、化学、材料实验

1、手套箱使用方法

2、转矩流变仪使用方法

3、扫描电镜测试方法

4、透射电镜测试方法

5、GPC测试流程

 

 

 

核酸电泳实验

  

  琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

 

  实验原理:当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶EB染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

  通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下进行琼脂糖电泳。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。

  一般情况下,分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

 

一、设备

  水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,照相支架, 照相机及其附件。

 

二、试剂


 1、5×TBE电泳缓冲液。

 2、6×电泳载样缓冲液。


 3、溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。

 

三、琼脂糖凝胶的制备


 1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。

 2、胶液的制备:称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。


 3、灌胶:

  (1)将有机托盘放入制胶模具上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。


  (2)向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。

  (3)将琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。

  (4)待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。


 4、加样:取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。


 5、电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。


 6、染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。


 7、观察和拍照:

  在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。

 

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

 

实验原理

  SDS-PAGE是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
  SDS是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材

试剂:

1. 5x样品缓冲液(10ml):0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油,2ml 10%的SDS,0.5ml巯基乙醇,1ml 1%溴酚蓝,0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。

2. 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水溶解后,定容到100ml。过滤后置棕色瓶中,4℃保存,一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液: Tris 36.3g ,加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调pH8.9,定容至100ml,4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液:Tris 5.98g ,加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调pH6.7,定容至100ml,4℃保存。

5. TEMED(四乙基乙二胺)原液

6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制)

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液:称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水约900ml,调pH8.3后,用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存,临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸馏水中,慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸,最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。

实验操作

(一)样品制备

  将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热 5-10min,取上清点样。

(二)分离胶及浓缩胶的制备

 1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净,用ddH2O 冲洗数次,再用乙醇擦拭,晾干;

 2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer,按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板;

 3 按如下体积配制10%分离胶8.0 ml,混匀;

ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30% Acr-Bis 2.8 ml
10% SDS 80 ul
10%AP 56 ul
TEMED  6 u

 4 向玻璃板间灌制分离胶,立即覆一层重蒸水,大约20 min后胶即可聚合;

 5 按如下体积配制6%浓缩胶3.0 ml,混匀;ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30% Acr-Bis

2.0 ml 400 ul 600 ul
10% SDS 10% AP TEMED
36ul 24ul 4ul

 6 将上层重蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳;

 7 装好电泳系统,加入电极缓冲液,上样20 μl;

 8 稳压200V,溴酚蓝刚跑出分离胶时,停止电泳,约需45 min~1hr.

 9 卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色1~2 hr;加入脱色液,置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液(10 ml 冰乙酸;45 ml乙醇;45 ml蒸馏水)至完全脱净。