实验指导
化学实验注意事项
近年来，高校实验室危险事故偶有发生，安全状况不容忽视。实验室可分为不同的种类，常见的有电力实验室，物理实验室，化学实验室，生物实验室，机械实验室等。各类实验室有不同的安全管理规定，生物实验室要求易去尘、耐磨和抗污染；物理和化学实验室则要按规定严格管理化学试剂等。
化学试剂危险警示图标
实验室发生爆炸事故起因有很多种，比如，最常见的就是：随便混合化学药品。氧化剂和还原剂的混合物在受热。摩擦或撞击时会发生爆炸。
表1中列出的混合物都发生过意外的爆炸事故。表2为不能混合的常用药品。
表1 加热时发生爆炸的混合物示例
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镁粉-重铬酸铵 |
有机化合物-氧化铜 |
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镁粉-硝酸银 |
氧化剂-硝酸铅 |
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遇水产生剧烈爆炸 |
氧化亚锌-硝酸铋 |
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镁粉-硫磺 |
浓硫酸-高锰酸钾 |
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锌粉-硫磺 |
三氯甲烷-丙酮 |
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铝粉-氧化铅 |
铝粉-氧化铜 |
表2 不能混合的常用药品一览表
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药品名称 |
不能与之混合的药品名称 |
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碱金属及碱土金属如钾、钠锂、镁、钙、铝等 |
二氧化碳、四氢化碳及其它氯代烃，钠、钾、锂、禁止于水混合。 |
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醋酸 |
铬酸、硝酸、羟基化合物，乙二醇类、过氯酸、过氧化物及高锰酸 |
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醋酸酐 |
同上，还有硫酸、盐酸、碱类 |
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乙醛、甲醛 |
酸类、碱类、胺类、氧化剂 |
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丙酮 |
浓硝酸及其硫酸化合物，氟、溴、氯 |
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乙炔 |
氟、溴、氯、铜、银、汞 |
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浓氨（无水） |
汞、氯、次氯酸钙（漂白粉）、碘、氟化氢 |
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硝酸铵 |
酸、金属粉末、易燃液体、氯酸盐、硝酸盐、硫磺、有机物粉末、可燃物质 |
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溴 |
氨、乙炔、丁二烯、丁烷及其他石油类、碳化钠、松节油、苯、金属粉末 |
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苯胺 |
硝酸、过氧化氢（双氧水）、氯 |
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氧化钙（石灰） |
水 |
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活性炭 |
次氯酸钙（漂白粉）、硝酸 |
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铜 |
乙炔、过氧化氢 |
特别提醒：因此，做实验前一定要了解实验原理，清楚实验风险，规范操作，并有稳妥的应对防护措施。
哪些不规范操作会爆炸？
由于实验操作不规范，粗心大意或违反操作规程都能酿成爆炸事故。
例如：
（1）配制溶液时，错将水往浓硫酸里倒，或者配制浓的氢氧化钠时未等冷却就将瓶塞塞住摇动都会发生爆炸。
（2）减压蒸馏时，若使用平底烧瓶或锥瓶做蒸馏瓶或接收瓶，因其平底处不能承受较大的负压而发生爆炸。
（3）对使用的四氢呋喃，乙醚等蒸馏时，由于这类试剂放久后会产生一定的过氧化物，在对这些物质进行蒸馏前，未检验有无过氧化物并除掉过氧化物，过氧化物被浓缩达到一定程度或蒸干易发生爆炸。
（4）制备易燃气体时，一定要注意附近不要有明火，在制备和检验氧气时，一定要注意不要混有其它易燃气体。例如氧气制备、氢气制备，实验中若操作不慎易发生爆炸（见着火一节）。
（5）金属钾、钠、白磷遇火都易发生爆炸。
化学危险品区别对待
1、剧毒性药品：氰化物、砷化物、生物碱等。
2、放射性药品：铀、钴60等。
3、腐蚀性药品：强酸、强碱、溴、甲醛、氢氧化钠等。
4、易爆药品及能成为爆炸混合物或引起燃烧的氧化剂：氯酸钾、氯酸钠、硝酸、过氧化钠、硝酸钾等。
5、易燃及助燃气体：氢气、乙炔气、煤气、氧气等。
6、易燃、易自燃及遇水燃烧的固体：赤磷、黄磷、废影片、钾、钠、电石等。
7、闪点在45℃及45℃以下的易燃液体：乙醚、汽油、二硫化碳、丙酮、苯、乙醇、丙醇等。
化学危险品的存储和保管
1、化学危险品进入实验室的试剂贮存室时，应严格检查与验收，并做好帐目登记工作，经常清点，每学期对帐一次，做到帐、物相符。
2、试剂贮存室内应符合安全条件，并配备适用的消防器材和防护用品，严禁烟火，杜绝一切可能产生火花的因素。
3、化学危险品应分类存放，试剂贮存室内存放的试剂不得过高过密，应限制最大储备定额，不应超储，互相有影响的药品不得混放，必须分库存储。
4、在存储的过程中必须根据化学危险品的性质，采取必要的保护措施，如防湿、防热、防晒、防冻，防风化等。经常检查，防止因变质、分解造成自燃、爆炸，及时排除一切不安全因素。
5、对化学危险品的管理，应选派工作认真负责并有一定保管知识的（专职）人员严加管理。
6、对剧毒物品必须严格执行专柜保管，实行两锁、两人保管，两人同时存取的管理制度，并做好详细记录，确保安全。
7、对剧毒物品的容器、废液、残渣等应及时妥善处理，严禁随意抛洒，否则由此引起的严重后果应由当事人负完全责任。
8、实验室主任对使用化学危险品要严格控制和监督，必须做好详细记录。
9、化学危险品如有丢失，应立即报告、及时处理。
生物实验注意事项
一、核酸技术
溴化乙锭(EB)：强诱变剂,能够嵌入碱基分子中导致错配，高致癌性。
Golden view：赛百盛称“未发现其有致癌作用”，但有报道其与吖啶橙(强致癌剂)高度相似，其安全性有待进一步评价。
焦碳酸二乙酯(DEPC)：潜在致癌物质，吸入时毒性最强，使用时应戴口罩和在通风橱中进行。
Trizol /Tri-reagent：含有苯酚，具有毒性和刺激性，皮肤接触后立即用大量去垢剂和水冲洗。
氯仿(三氯甲烷）：致癌剂，易挥发，可损害肝和肾。
二、蛋白技术
i. Western blot
丙烯酰胺：中等毒性物质，可致癌，累积毒性，不易排毒，主要引起神经、生殖与发育的毒性。
NN-亚甲双丙烯酰胺：有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末。
过硫酸铵(APS)：对黏膜、上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性，吸入可致命。
四甲基乙烯二胺(TEMED)：强神经毒性，防止误吸，操作时快速，存放时密封。
二硫苏糖醇(DTT)：吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。
苯甲基磺酰氟(PMSF)：吸入、咽下或皮肤吸收而致命。
十二烷基硫酸钠(SDS)：有毒，刺激性，高热分解放出有毒气体造成眼睛的严重损伤。
甲醇：神经麻醉作用，引起脑水肿。
ii.免疫组化
叠氮钠(NaN3)：毒性非常大，可因吸入、咽下或皮肤吸收，操作时。
丙酮：微毒类，主要是对中枢神经系统的麻醉作用，能刺激眼睛。
吉姆萨(Giemsa)：毒性，危害不可逆性，吸入或皮肤吸收，应在通风橱操作。
甲醛(福尔马林)：毒性大，致癌，腐蚀性，易挥发，也通过皮肤吸收。蚀性，易挥发，也通过皮肤吸收。
三、细胞实验
二甲基亚砜(DMSO)：对皮肤有极强的渗透性，与蛋白质疏水基团作用，导致蛋白质变性，具有血管和肝肾毒性，吸入高挥发浓度可致头痛、晕眩。
四、实验动物实验安全
(一)实验动物分级：
一级（普通级动物）：如大动物比格犬、恒河猴、小型猪等，及中小型动物如豚鼠、家兔等。
二级（清洁级动物）：豚鼠、家兔，大、小鼠均为二级以上。
三级（无特定病原体（SPF）动物）：豚鼠、家兔大、小鼠
四级（无菌级动物）：裸鼠、无菌豚鼠、无菌大小鼠。
(二)实验动物使用过程生物安全的相关因素
1、动物因素
完整的资料
品种、品系、遗传背景或其来源清楚
微生物检测状况
质量合格证号、生产许可证号
2、实验环境和设施的配备
隔离检疫室、饲养室、实验处置室、储存室等
3、实验操作者因素
严格做好防护穿工作服、戴帽子、手套、口罩
(三)动物实验安全注意事项
1、不同级别的动物在相应的环境中进行实验
不得将普通级动物带进屏障环境中实验
不得将带出屏障环境的实验动物，再带回屏障环境
2、特殊改造的实验室：涉及传染性、中毒性、放射性、致癌性、致突变或致畸性动物实验
3、实验动物废弃物处理：
无污染的实验动物尸体：及时装入专用塑料袋密封后，当天送回动物中心不得随意丢弃。
已污染或具有危险性的动物尸体及组织：按规定收集、分离、包装标识后当天送回动物中心，统一运输到特定场所焚烧
4、动物咬伤或挠伤处理方法：
(1)凡不能确定伤人动物是否健康，应立即对受伤部位进行彻底清洗和消毒，越早越好，24-48小时内。
(2)SPF级动物咬伤：建议注射破伤风及流行性出血热抗毒素。
(3)伤口处理：
①彻底冲洗：肥皂水、清水、碘制剂或乙醇等，持续冲洗20分钟。
②严格消毒：2-3%碘酒或75%酒精涂于伤口。
③酌情处置：
a.未伤及大血管的伤口不要缝合及包扎；
b.较大伤口或比较严重的浅部伤口,清创消毒后,先用狂犬病免疫血清或球蛋白浸润伤口, 数小时后(不低于2小时)再予缝合包扎。
c.伤口深而大者:放置引流条,并使用抗生素和破伤风抗毒素以控制感染
④接种疫苗:越早越好。已受伤一段时间而未接种狂犬病疫苗者,也应按接种程序接种疫苗。
- 生物性安全事故
【案例1】传染性疾病 2010年12月19号的一次实验，改变了东北农业大学28名师生的人生轨迹。这是一次羊活体动物实验，先解剖，再肢解，最后观察羊内脏。整堂解剖课从上午一直持续到下午，它的结果却是：28人感染严重布鲁氏杆菌传染病。
- 实验设备安全事故
【案例1】厌氧培养箱 2009年10月25日，北京理工大学实验室发生爆炸：北京理工大学5号教学楼9层实验室发生爆炸，5人受伤。爆炸的厌氧培养箱为新购进的设备，调试中可能因压力不稳引发事故。
【案例2】储气钢瓶 2015年4月5日，中国矿业大学南湖校区化工学院实验室发生储气钢瓶爆燃事故，5人受伤，其中1人抢救无效死亡，1人重伤截肢；
【案例3】加热设备 2010年6月21日，宁波大学重点实验室——应用海洋生物技术教育部重点实验室-种质资源保护与良种选育实验室发生大火，原因是两个粗心的学生正在该实验室做实验：用电磁炉熔化石蜡。后来暂时离开了一会，没想到就发生了火灾。
【案例4】高压反应 2011年12月7日上午11点左右，南开大学一名女生在做化学实验时发生了意外，手部严重受伤。实验台上一片狼藉，阳台地上散落着被爆炸震碎的玻璃。受伤女生是南开大学化学学院无机专业的一名博士生，从爆炸的程度来看，初步推断当时可能正在做高压化学实验。这名女生被送往了武警医院，医生透露，除了面部和颈部有大面积擦伤外，这名女生手部严重受伤。
【案例5】气体泄漏 2012年2月15日，南京大学实验室发生甲醛泄漏，事故中不少学生喉咙痛、流眼泪，感觉不适。实验室飘出白色气体，捂鼻、眯眼、一路小跑，师生紧急疏散。原因是老师做实验时违规离开。
- 易燃易爆试剂
【案例1】丁基锂自燃 2008年12月，加州大学洛杉矶分校（UCLA）一名23岁研究助理Sheharbano Sangji在实验室取用丁基锂的过程中，因注射器活塞滑脱，导致药品暴露在空气中发生自燃，她的衣服着火。尽管实验室中有紧急淋浴装置，但Sangji却没有去使用它灭火，她尖叫着在实验室中来回奔跑。由于当时她没有穿实验工作服，因此造成了三度烧伤;18天后，她在医院离世。
2011年，她的导师Patrick Harran教授也成为美国首个因实验室事故而面临违反健康安全标准等3项罪状刑事指控的有机化学家。他需要向Sangji接受治疗的烧伤病房支付1万美元，并在5年的时间内履行以下条款才可能避免牢狱之灾：设置实验室安全培训课程作为其所教授的有机化学课的一部分；告知即将入学的UCLA新生实验室安全的重要性；在医院进行800个小时的与教学无关的社区服务。
马萨诸塞州纳蒂克实验室安全研究所所长Jim Kaufman说，这场法律诉讼是“规则改变者”，这将显著影响人们思考自身责任的方式，以及释放一个很清楚的信号：有坐牢的可能性。 UCLA校长Gene Block说：“这场事故是一次悲剧，但不是一次犯罪。”
【案例2】氢气瓶泄漏 2015年12月18日上午，清华大学化学系何添楼一实验室发生火灾事故，一名博士后不幸遇难。当天所进行的实验是催化加氢实验，实验所用氢气瓶意外爆炸、起火。
【案例3】实验物料爆炸 2011年4月14日，四川大学江安校区第一实验楼B座103化工学院一实验室三名学生在做常压流化床包衣实验过程中，实验物料意外发生爆炸，3名学生受伤。
【案例4】双氧水爆炸 2010年6月9日，由于做实验时发生差错，中国科学院大连化学物理研究所一实验室发生爆炸，部分居民家玻璃被震碎，所幸没有造成人员伤亡。爆炸化学物品为双氧水。
【案例5】乙醚引燃 2005年 8月8号,首都师范大学化学系在实验楼二层的一个实验室在做实验时不慎引燃乙醚发生火灾,造成两人被烧伤。
- 放射性物质
【案例1】废弃物 某高校进行实验室搬迁，雇了一些民工来负责搬运清理，其中有位民工发现某仓库中有十几只篮球般大小的铅罐，觉得好玩，就打开了一只，看看只有几颗小金属粒就准备重新盖好，这时正好有知情的老师过来，告诉他这是放射性物质专门储藏罐，并告之这位民工他已受到了辐射，需马上送医院检查。所幸的是该放射性物质的强度一般，而且接触时间短，送医院及时，这位民工住院半个月，身体就慢慢恢复了健康。【分析与教训】该实验室的管理虽已采取了一定的措施，但仍不规范，台账不是很清楚，搬运时又没有专门人员负责，这是管理上的问题。而从民工的角度来说，缺乏基础知识，好奇心强，盲目操作，终于造成伤害。因此，对于放射性物质的采购、保管、使用和废弃都必须严格按照规定执行，杜绝随意、不负责任的行为，保障人身安全。
- 信息安全
【案例1】数据资料《每日新报》2004年9月17日报道，2004年7月初，洛斯阿拉莫斯国家实验室一个管区内的研究人员发现两张存有重要数据的光盘失踪，负责管理该实验室的加利福尼亚大学宣布，暂停这个实验室的一切具有保密性质的研究工作，全面查找丢失的绝密资料。有4名雇员因涉嫌泄密被开除，1名被要求辞职，7人被降职、减薪或被要求写检查。【分析与教训】洛斯阿拉莫斯国家实验室是全球第一颗原子弹的诞生地，信息安全受到了最严格的控制。但是，实验室一直受到设备失窃和管理不善的困扰，信息安全事故时有发生，比如，当年5月，报告有机密文件丢失了，后来说是销毁了；6月，一个敏感区域的钥匙丢失了一整天。可见，实验室信息安全绝非小事。
- 其它
【案例1】火灾 2010年5月15日，巴西最大生物研究所――布坦坦研究所发生火灾，许多珍藏了近百年的动物标本被毁。存放众多蛇类、蝙蝠和蝎子等标本的大楼灾情严重，许多存放了近百年的标本毁于一旦。不过好在抢救及时，所有用作研究的活体生物被安然转移到安全地带。布坦坦研究所当天发表公报称，当地政府已经获悉灾情，并承诺将拨款重建。布坦坦研究所创立于1901年，位于巴西最大城市圣保罗西郊，是巴西乃至南美洲地区最大的生物研究所，其研制的疫苗广泛应用于巴西医药领域。
聚合物表面细胞形态分析
目的意义：
- 研究细胞在材料表面的粘附、生长和扩展，反映材料界面性质与细胞行为的直接互相作用关系，对合成新材料进行细胞相容性批量筛选。
实验原理：
- 细胞的粘附、生长、扩展和迁移等细胞行为与材料表面的物理化学性质密切相关，不同材料的表面界面性质微小差异即会影响各种细胞行为。将聚合物在盖玻片表面涂膜，接种培养相应细胞，并应用计算机形态学图像分析系统可识别、检测材料表面生长的细胞数量和相关形态参数，定量分析和评估材料对细胞粘附和细胞形态的影响。
操作方法：
1 材料准备
- 玻片硅化处理：盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min，待其冷却后，倒掉盐酸，去离子水漂洗玻片，自然干燥；通风条件下，将单片的盖玻片在2%二甲二氯硅烷（dimethyldichorsilane，DMDC）液中浸几下，竖在架子上干燥；然后，收集于可耐热的petri氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗；用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于180℃烘烤4h以上；冷却至室温后备用。硅化处理后盖玻片，可用于氯仿等溶解的亲油性聚合物的铺膜。
- 多聚赖氨酸（PLL）包被：盖玻片经严格清洁处理后，95%乙醇脱脂过夜，凉干，以0.5%PLL浸渍数次进行包被，干燥后4℃冰箱保存备用。PLL包被的盖玻片既可用于氯仿溶解的亲油性聚合物铺膜，也可用于极性溶剂DMF等溶解的双亲性共聚物的铺膜。
- 聚合物涂膜：将聚合物溶解于氯仿或DMF，配制成1%氯仿或DMF溶液，以推片或浸渍方式于盖玻片涂膜，常温干燥30min，真空干燥48h，紫外照射消毒20min后备用。
2 接种细胞
- 将盖玻片置于六孔板内，每孔先添加3ml含血清培养液。将收获的细胞制成浓度为1×105/ml细胞悬液，每孔添加1ml，使每孔细胞数为1×105，培养24h，于不同时间段，取出玻片，PBS冲洗三次，2.5%戊二醛固定30min，Giemsa染色或1%甲苯胺蓝染色30min，凉干，中性树脂封片，显微镜10倍物镜下按“田”字布点拍摄9张照片。
3 计算机形态识别
- 以NIH Image J形态识别软件对每张照片进行计算机细胞形态识别和分析。方法：打开（图片文件）→设定标尺→将图片转换为二维图像→形态识别，获得图片内的细胞数量和每个细胞的形态参数→保存结果为TXT文件。识别后的形态参数包括Area，Mean，StdDev，Mode，Min，Max，X，Y，XM，YM，Perim.，BX，BY，Width，Height，Major，Minor，Angle，Circ，Feret等。
4 数据处理与统计分析
（此部分，可选择自己熟悉的统计软件处理，仅供参考学习）
- 采用Visual FoxPro系统设计的数据接口程序（见图2-2），将每张照片识别后的数据读入、筛选，经分组统计处理后，获得细胞数（每个视野）、细胞平均面积、周长、圆形度、Feret直径等参数。
Visual FoxPro数据接口程序主要原理：
***Image J数据分析系统***
- CREATE CURSOR mytable1（my_group n（2）,my_no n（10）,my_Label n（10,2）,my_Area n（10,2）,… my_Circ n（10,2）,my_Feret n（10,2）） &&建立临时表mytable1，根据Image J保存的文本文件中分析参数及其所占的字符数，设定临时表的字段和字段长度
- APPEND FROM *.txt SDF &&将Image J分析结果，读入数据表
- CALCULATE COUNT（my_no）, AVG（my_Area）, STD（my_Area）,…, AVG（my_Feret）, STD（my_Feret） TO a, b,…,y, z &&利用Visual FoxPro的统计函数，分别对所需要的各个参数进行统计分析，获得每张照片的细胞数（COUNT）和每个形态参数的均数（AVG）和标准差（STD）。
- CREATE CURSOR mytable2（my_image n（2）, my_count n（10）, my_Area_AVG n（10,2）, my_Area_STD n（10,2）, …, my_Feret_AVG n（10,2））, my_Feret_STD n（10,2）） &&创建临时表mytable2
- INSERT INTO mytable2（my_image n（2）, my_count n（10）,my_Area_AVG n（10,2）, my_Area_STD n（10, 2）, …, my_Feret_AVG n（10,2）） VALUE（a, b,…,y, z） &&将上述统计结果读入临时表mytable2
- COPY TO *.txt SDF &&将统计结果导出为固定格式的TXT文本文件，该文件内的数据可被读入Excel或Origin等统计软件作进一步的统计分析和绘制统计图表。
- ***Image J数据分析系统***
参考文献：
- Yang Cui, Yi Liu, Yi Cui, Xiabin Jing, Peibiao Zhang*, XuesiChen.The Nano-Composite Scaffold of Poly(lactide-co-glycolide) andHydroxyapatite Surface-Grafted with L-lactic Acid Oligomer for Bone Repair. Acta Biomaterialia, 2009, 5：2680－2692.
- PeibiaoZhang, Haitao Wu, Han Wu, ZhongwenLù, Chao Deng, Zhongkui Hong, XiabinJing, XuesiChen.RGD-conjugated copolymer incorporated into composite of poly(lactide-co-glycotide) and poly(l-lactide)-grafted nanohydroxyapatite for bone tissue engineering. Biomacromolecules 2011, 12 (7): 2667–2680
- Zhongkui Hong, Peibiao Zhang, Chaoliang He, XueyuQiu, Aixue Liu, Li Chen, Xuesi Chen and Xiabin Jing. Nano-composite of poly(L-lactide) and surface grafted hydroxyapatite: Mechanical properties and biocompatibility. Biomaterials, 2005, 26(32):6296-6304.
核酸电泳实验
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。
实验原理：当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶EB染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下进行琼脂糖电泳。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
一般情况下，分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%，DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
一、设备
水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机， 恒温水浴锅， 微量移液枪， 微波炉或电炉，紫外透射仪，照相支架， 照相机及其附件。
二、试剂
1、5×TBE电泳缓冲液。
2、6×电泳载样缓冲液。
3、溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
三、琼脂糖凝胶的制备
1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。
2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
3、灌胶：
（1）将有机托盘放入制胶模具上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
（2）向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/ml(也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。
（3）将琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。
（4）待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。
7、观察和拍照：
在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
实验原理：
SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：
试剂：
1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8)，5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
实验操作
（一）样品制备
将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热 5－10min，取上清点样。
（二）分离胶及浓缩胶的制备
1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；
3 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；
ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30% Acr-Bis 2.8 ml
10% SDS 80 ul
10%AP 56 ul
TEMED 6 u
4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
5 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30% Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10% SDS 10% AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;
8 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.
9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上，每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。
免疫荧光实验
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理：
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、应用范围：
其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。
3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。
4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
四、注意事项：
1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3、二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
4、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
5、洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
7、DAPI染色30s，用PBS充分清洗3次。
8、抗淬灭剂可拿来直接封片，20微升即可，之后片子可保留更长时间。
9、荧光共聚焦显微镜观察或荧光相差显微镜观察。
五、荧光物质：
1、荧光色素
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490–495nm，最大发射光波长520–530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
(2)四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
2、其他荧光物质
（1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
（2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3
螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
六、常见荧光素的特性：
1、FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光（图1a）。
2、RB200：橘红色粉末， 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
3、TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光（图1b）。
4、镧系：Eu、Tb
5、PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。
6、DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的细胞核的染色（图1c）。
7、其它：酶作用后产生荧光物质。
常用动物模型
一、桡骨缺损模型：
实验动物：新西兰兔或日本大白兔
实验操作：
1. 动物麻醉：生理盐水与鹿眠灵按照1:24 稀释25倍后，约0.6-0.8ml/kg剂量肌肉注射。
2. 兔桡骨缺损模型的建立：
（1）双侧前肢备皮后，将兔置于腹卧位，四肢外展固定于手术台上，强力碘消毒双侧前肢，铺无菌巾。
（2）沿前臂桡骨中下段纵切长约3-3.5cm的切口，钝性分离皮下组织、筋膜、肌肉；
（3）分离切开骨膜后，沿骨膜下分离暴露桡骨；
（4）以距桡骨远端约1cm为远端切割点，往近侧20mm为近端切割点，画样并切割；
（5）取出桡骨中下段20mm 的节段性骨缺损，修整肢体两侧断端并压迫止血。
3. 材料植入：
（1）缺损处经生理盐水冲洗，去除血凝块。
（2）将不同组别的材料分别植入缺损处，注意材料与骨断端处应无肌肉或其他软组织嵌入。
（3）空白对照组为缺损不作任何处置。
（4）分层缝合创口，对合皮肤，强力碘消毒。
（5）在术后1周内，每只兔每天肌注青霉素40万单位。
注意事项：
1.钝性分离时，尽可能不破坏皮层及肌层的静脉血供，注意避免伤及动脉。
2.电钻磨取骨缺损时，将周围骨膜一并摘取。
3.实验动物须随机分组，每只兔左右桡骨分别植入不同材料，最好交叉设计。
二、颅骨缺损
（待续…）
三、胫骨平台缺损
（待续…）
手套箱使用方法
1、打开过渡室外门，放入实验物品，关好外门。
2、先打开真空泵，然后逆时针旋转打开真空阀，开始抽真空。
3、抽真空至压力表值为-0.1 MPa时，即关闭真空阀，然后关闭真空泵。
4、打开充气阀，通氮气至压力表值为0时，关闭充气阀。
5、重复抽真空、冲氮气过程三次。
6、点击控制面板上的照明，并在设定中点击默认值后确认。
7、打开手套口密封盖，逆时针旋转打开过渡室内门，将实验物品转移至主体箱，关闭内门后即可实验操作。
8、实验完毕，打开内门，清理好主体箱后将物品转移至过渡室，关闭内门，打开外门取出物品。
9、将控制面板上设定内的上压设定点设为+1.2 mbar，下压设定值为0.1 mbar，将过渡仓抽上真空。
10、关闭外门，手套口加盖密封。
扫描电镜的使用方法
一、 样品制备
将分散好的样品滴于硅片上，干燥后将载有样品的硅片粘在样品座上的导电胶带上（对于大颗粒样品可直接将样品粘在导电胶带上）。 对于导电性不好的样品必须蒸镀导电层，通常为蒸金
二、操作程序
1、仪器处于正常状态时，若高压20 kv(25 kv、15 kv、10 kv)正在工作（显示黄色），先点击高压使之变为灰色，然后点击VEDT使样品室放气，3-4 min后轻轻拉门，如果不能拉开再等一会
2、轻轻拉开样品室的门，放入样品，注意样品高度不能超过规定的高度
3、轻轻关上门，右手推着样品室的门，左手点击PUMP，等到样品室被吸上后（这时会听到较大响声），放开右手，等至样品室的真空至VAC OK
4、点击20 kv(25 kv、15 kv、10 kv)，稍后出现对话框，点击OK
5、放大倍数至最小，找到自己的第一个样品，放大到500倍左右聚焦至最清晰，点击Z-FWD,然后在Z中选10.00，点击go-to或Enter
6、开始测试：在图像中双击左键可以朝该方向移动选区，单击右键左右移动可调焦距，高倍镜下shift+右键对角线移动可调相散，F2键可进一步优化图像。存图流程为Freeze Image，In/Out-Image-Save（自命名），解冻后可换区继续测试。
7、图片存储路径为My computer\c:\xl\usr，在测试电脑桌面上新建文件夹，将所需图片粘贴至该文件夹，右侧电脑photo sem中即可看到所需文件夹，压缩后邮箱发送。
8、关机点击20 kv(25 kv、15 kv、10 kv)和控制台的HT
注意事项：无论什么情况，都不要动控制台上除HT以外的任何按钮
若有问题，请打电话138 4497 2856
透视电镜的使用方法
一、上样品杆：
上样前确保样品区灯灭，电子阀关闭（Col.Valves），插样品杆的前一半，样品台的红灯变亮，勾选提示区的Single tilt，并用鼠标点回车键，等待抽真空。大约5 min后真空抽好，样品台上的灯灭，再转进后一半样品杆（逆时针转至正下方，20 s内完成）
二、打开样品阀，点开CCD（小鹿标识），使CCD处于工作状态，找样品时缩小倍数，操作如下：
1. 逆时针旋转右面板上调节倍数旋钮，缩小到390倍，移动样品杆（黑色杆），找到符合要求的区域，移动至视野中间
2. 直接调节放大倍数旋钮Magnification放大到2250，左面板上的Intensity旋钮调光斑大小，使光斑边缘略小于荧光屏边缘，如果光斑不正，用左侧滚球调整
3. 调高度：按右侧面板上Eucentric focus，将放大倍数调到38000，旋转左侧Intensity，将光斑缩成一个点，长按右面板上最右面E-axis上下箭头，并使中心束斑周围的光晕收缩至一点，然后将光斑散开到合适大小并将光斑移正
4. 拍照：选择所需要观察的区域并移动到荧光屏中心，点击R1抬起荧光屏，通过电脑上的CCD观察样品形貌，调节右侧聚焦旋钮focus的上层纽调焦距（下层纽控制调焦步长）。一般focus step放在2或3，需低倍快速时放到5，照高分辨时放到1，点照相机标识可照相，并在Digital micrograph软件中的file中保存，E盘TEM date中
5. 放大缩小倍数：按R1使荧光屏落下，调节Magnification及左侧Intensity,荧光屏抬起时不能调节Magnification
三、下样品杆：
首先要将荧光屏落下，关闭电子阀，点击左上角search里的holder，使右下角样品的位移x、y、z的示数为零，归零后拔样品杆，拔不动时顺时针旋至正上方拔出。
注意：如果高压掉了，即High Tension变灰，请及时联系负责老师，切勿擅自操作。
GPC测试流程
一、进空白样之前：
仪器开关打开，进样器流速从0以0.1的速度升至1 mL/min（注意改变泵的流速时，以每次±0.1的幅度变动，每变动一次，需稳定电压值）；调检测器sensitivity16,温度35℃，按shift+1启动，然后按auto zero，使其值的变化稳定在±10，约需1 h。关掉shift+1，按auto zero，使其值的变化稳定在±10。
二、进空白样：
打开进样伐，命名，选择宽分布进样（每次都需重新选择一下）。出现等待进样，注射空白样（CHCl3），扭动进样伐从Load位置至INJECT位置，样品检测30 min。
三、进未知样（即所测样品）：
关进样伐，弃0.2 µm滤头（绿色），用洗样水（CHCl3）洗注射器3次，取已用0.45 µm滤头（白色）过滤的样品0.5 mL，加0.2 µm滤头，先挤出几滴样品液，注射器内尽量无气泡，然后进未知样测量，步骤同进空白样。
四、数据拷贝：
1、查询数据→通道，更新（双击）,选择样品单击右键，改变样品为宽分布未知样，保存→文件→打开→处理方法→CHCl3+日期（选择最新日期）→拉线（选峰位置），点击定量（左上角蓝色按钮）→文件→保存，全部。
2、查询数据→结果，更新→选择样品，数据库→导出数据→命名后加-（短-），保存。
3、选择样品→预览→确定→保存。
五、关仪器：
流速从1 mL/min以-0.1的速度降至0，每变动一次需稳定电压值，关闭开关按钮。